免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。

一、SP法步驟

1. SP三步法

脫蠟→梯度水化→滅活內(nèi)源性過氧化物酶→抗原修復(fù)→封閉→一抗孵育→二抗孵育→SP反應(yīng)→DAB顯色→蘇木素復(fù)染→常規(guī)脫水→透明→封片

2、免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

①脫蠟和水化

②抗原修復(fù)

③滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素

④血清封閉

⑤一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間

⑥切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

⑦DAB顯色

⑧復(fù)染

⑨脫水透明

⑩封片

二、異常分析

1、非特異性染色

①抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。

②一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體。

③內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織)，需要通過延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色。

④非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長(zhǎng)二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果。

⑤DAB孵育時(shí)間過長(zhǎng)或濃度過高。

⑥PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。

⑦標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

2、呈陰性結(jié)果

①抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度。

②抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合。

③組織切片本身這種抗原含量低。

④血清封閉時(shí)間過長(zhǎng)。DAB孵育時(shí)間過短。

⑤細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

三、重要信息

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